ดีเอ็นเอ หรือ Deoxyribonucleic (DNA) คลังข้อมูล พันธุกรรมทำหน้าที่ควบคุมและถ่ายทอดลักษณะทางพันธุ- กรรมต่างๆ ของสิ่งมีชีวิต โดยดีเอ็นเอจะประกอบด้วยหน่วย ย่อยพื้นฐานที่เรียกว่า นิวคลีโอไทด์ (nucleotide) ซึ่งเป็น ชุดของโมเลกุลฟอสเฟต น้ำตาลเพนโตส และเบสหรือ สาร เคมีที่มีสมบัติเป็นด่าง 1 ตัว ซึ่งเบสจะมีอยู่ 4 ประเภท คือ adenine (A) , guanine (G) , cytosine (C) , thymine (T)

ลักษณะโครงสร้างของดีเอ็นเอประกอบขึ้นจากสายชุด นิวคลีโอไทด์ 2 สายที่มาพันเข้าด้วยกันเป็นลักษณะเกลียวคู่ (double helix) หรือบันไดเวียน โดยมีเบสที่เรียงรายอยู่ ตามสายแต่ละสาย ทำหน้าที่ยึดจับระหว่างสายทั้งสอง และปรากฏว่าสายส่วนที่มีเบส A จะจับคู่สร้างพันธะกับเบส T และส่วนที่มีเบส G จะจับคู่เบส C ซึ่งการจับคู่กันนี้เรียกว่า เป็นเบสคู่สม และแต่ละส่วนบนสายดีเอ็นเอนี้เองที่เป็นที่อยู่ของยีน (gene) ซึ่งเป็นส่วนที่บรรจุข้อมูลสำหรับ การสร้างโปรตีนชนิดใดชนิดหนึ่ง โดยยีนที่ต่างกันก็จะมี ตำแหน่งที่อยู่และการเรียงลำดับของเบสบนตัวมันแตกต่าง กันไป

Polymerase Chain Reaction หรือ (PCR) เป็น เทคนิคสำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ โดยอาศัยหลักการ DNA Replication ซึ่งเป็นการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอสายใหม่ จากดีเอ็นเอต้นแบบในหลอดทดลองภายในระยะเวลาอันสั้นและได้ดีเอ็นเอสายใหม่เกิดขึ้นเป็นล้านเท่า เทคนิคนี้พัฒนา ขึ้นเมื่อปี 2528 โดย Kary Mullis และคณะแห่งบริษัท Cetus Corporation จุดเด่นของเทคนิค PCR คือ สามารถ เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้อย่างเฉพาะเจาะจงโดยมีขั้นตอนการทำงานน้อยและใช้เวลาน้อย จนถึงปัจจุบันนี้เทคนิค PCR ได้รับการปรับปรุงและพัฒนาในหลายๆ ด้านจนกระทั่งได้รับ

การยอมรับว่าเป็นเทคโนโลยีที่สำคัญมากต่องานด้านอณู ชีวโมเลกุล สามารถนำไปใช้ประโยชน์ได้ทั้งกับงานวิจัยทาง ชีวโมเลกุลและพันธุวิศวกรรม เช่น การเพิ่มปริมาณยีน (gene cloning) การวิเคราะห์ลำดับเบสของยีน (gene sequencing) การสร้างดีเอ็นเอติดตาม (DNA probe) และการวิจัยประยุกต์ เช่น การศึกษาการแสดงออกของ ยีนจาก mRNA การสร้างยีนกลายพันธุ์ (in vitro mutagenesis) การบ่งชี้ตำแหน่งกลายพันธุ์บนยีน (point mutations and deletions) เป็นต้น

หลักการ PCR พื้นฐานในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ จากสายดีเอ็นเอต้นแบบหนึ่งสายด้วยเอนไซม์ DNA polymerase ซึ่งใช้กันอยู่ทั่วไปในการติดฉลากดีเอ็นเอ และ การศึกษาวิเคราะห์ลำดับเบส แต่ PCR สามารถสังเคราะห์ ดีเอ็นเอได้คราวละ 2 สายพร้อมกัน โดยใช้ไพรเมอร์ (primer) 1 คู่ ปฏิกิริยา PCR มี 3 ขั้นตอน และหมุนเวียน ต่อเนื่องกันไป ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมของแต่ละขั้นตอน

ขั้น 1 เรียกว่า denaturing เป็นการแยกสายดีเอ็นเอต้นแบบจากสภาพที่เป็นเส้นคู่ ให้เป็นเส้นเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิสูง 92-95o C

ขั้น 2 เรียกว่า annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงและ จัดให้ไพรเมอร์ ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ (ประกอบด้วย นิวคลีโอไทด์จำนวน 14-13 เบส) ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอต้นแบบ จับคู่กัน ซึ่งนิยมใช้อุณหภูมิในช่วง 37-60o C

ขั้น 3 เรียกว่า extension เป็นขั้นตอนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ โดยสังเคราะห์ต่อจากส่วนปลาย 5 ของไพรเมอร์ ตามข้อมูลบนดีเอ็นเอต้นแบบแต่ละสาย โดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอ็นไซม์นี้สามารถทำงานได้ดี ที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75o C เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอเรสที่ใช้ควรจะคงคุณสมบัติอยู่ได้ภายใต้สภาวะของปฏิกิริยา ตลอดทั้งสามขั้นตอน

จากขั้นตอนที่ 1-3 ซึ่งนับเป็นจำนวน 1 รอบ (one cycle) จะให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็น คู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า เมื่อจัด ให้เกิดปฏิกิริยาลูกโซ่จากขั้นที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีก หลาย ๆ รอบจะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้มากมาย ประมาณว่า ปฏิกิริยา 20 รอบ สามารถเพิ่มปริมาณสารดีเอ็นเอไม่ได้ น้อยกว่า 100,000 เท่า

เนื่องจากการทำ PCR เป็นการสร้างสายดีเอ็นเอสายใหม่ ในหลอดทดลอง จึงต้องมีการเติมสารเคมีและสารตั้งต้นที่ เกี่ยวข้อง จะผสมกันไว้ในหลอดทดลองเล็ก จากนั้นนำ หลอดที่มีการผสมสารต่างๆ เรียบร้อยแล้ว ไปใส่ไว้ในเครื่อง ควบคุมอุณหภูมิที่เรียกว่า DNA thermal cycler หรือ นิยมเรียกว่า PCR machine ที่ปรับอุณหภูมิได้ตาม โปรแกรมที่กำหนด จะเกิดการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ขึ้น ในหลอด โดยระยะเวลาที่ใช้ในขั้น denaturing annealing และ extension อยู่ในช่วง 15 วินาที ถึง 10 นาที ดังนั้นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยวิธี PCR 25-40 รอบ จะใช้เวลาประมาณ 1.5-5 ชั่วโมง เมื่อเกิดปฏิกิริยาจนครบ รอบและระยะเวลาที่กำหนดจะได้ผลผลิตดีเอ็นเอที่ต้องการ เป็นจำนวนมาก

ดีเอ็นเอที่เกิดจากปฏิกิริยา PCR ในหลอดทลองจะไม่ สามารถมองเห็นด้วยตาเปล่าได้ ดังนั้นเพื่อตรวจหา ดีเอ็นเอผลผลิตจะต้องนำตัวอย่างที่ทำ PCR มาแยกหา ดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคที่เรียกว่า agarose gel electrophoresis ซึ่งเป็นการแยกดีเอ็นเอด้วยกระแสไฟฟ้า บนแผ่นวุ้น (Agarose gel) โดยระยะทางที่ดีเอ็นเอสามารถ เคลื่อนที่ไปได้จะขึ้นอยู่กับขนาดของดีเอ็นเอและกระแส ไฟฟ้าที่ใช้ ดีเอ็นเอที่แยกโดยวิธีนี้สามารถมองเห็นได้ เมื่อย้อมด้วยสีพิเศษ ซึ่งจะเรืองแสงเมื่อเจอกับแสงอัลตรา- ไวโอเลต ซึ่งจะเห็นแถบดีเอ็นเอเรืองแสงบนแผ่นวุ้น

ปัจจุบันนี้นับได้ว่า PCR เป็นเทคนิคสำคัญ มากในงานอณูชีวโมเลกุล ทั้งที่เป็นงานพื้นฐาน ในห้องปฏิบัติการไปจนถึงการประยุกต์ใช้ทาง การแพทย์และการเกษตรสามารถใช้ในการ วินิจฉัยโรคต่างๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจาก พันธุกรรม ศึกษาความผันแปรหรือกลายพันธุ์ ของพันธุกรรมหรือยีน ทำแผนที่ยีนและศึกษา ลำดับเบสของยีนของสิ่งมีชีวิตได้ทุกชนิด ทั้งนี้ เนื่องมาจากเทคนิคนี้สามารถเพิ่มจำนวน ดีเอ็นเอที่สนใจศึกษาให้มีปริมาณมากในเวลา อันรวดเร็ว และเป็นเทคนิคที่ทำได้ง่าย

ประโยชน์ของ PCR ทางด้านการแพทย์ ได้แก่ การตรวจวินิจฉัยโรคโดยการตรวจหา เชื้อไวรัสหรือแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของโรค (เช่น โรคเอดส์ วัณโรค มาเลเรีย) การตรวจหา ยีนก่อมะเร็ง (เช่น มะเร็งเต้านมมะเร็งลำไส้ใหญ่)ทางด้านการเกษตร PCR มีบทบาทมากในงานด้านการปรับปรุงพันธุ์พืช การตรวจสอบสายพันธุ์พืช การตรวจ วินิจฉัยโรคสายพันธุ์พืชต้านทานโรค การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างพืชกับเชื้อโรครวมทั้งศึกษายีนกับตัวอื่น ๆ ของพืช และเชื้อโรค และการแสดงออกของยีนเหล่านั้นได้ ซึ่งเทคนิค PCR นี้ช่วยให้เข้าใจถึงพันธุกรรมของเชื้อโรคพืชและ พืชอาศัย ตลอดจนการนำไปใช้ในการป้องกันกำจัดโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส หรือเชื้อสาเหตุโรคอื่น ๆ

ขณะนี้เทคนิค PCR ได้ถูกนำมาใช้ในอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงกุ้ง ซึ่งเป็น อุตสาหกรรมส่งออกที่ทำรายได้ให้กับ ประเทศไทย 4-5 หมื่นล้านบาทต่อปี แต่ในปัจจุบันนี้เกษตรกรเริ่มประสบปัญหาจากโรคระบาดในบ่อเลี้ยงกุ้ง ซึ่งมีผลต่อ ผลผลิตกุ้งส่งออก ทำให้ประเทศไทยสูญเสียรายได้ถึงปีละ 1-2 หมื่นล้านบาท สาเหตุของโรคระบาดในกุ้งที่พบ ส่วนใหญ่เกิดจากเชื้อไวรัสซึ่งต้องใช้เทคนิค PCR ในการตรวจสอบ ทำให้สามารถป้องกันการแพร่ระบาดของ โรคได้ทันท่วงที นอกจากนี้การคัดเลือกสายพันธุ์กุ้งที่ดีเพื่อใช้ในการผสมพันธุ์ซึ่งมีความแปรปรวนพันธุกรรม (genetic diversity หรือ Variation) สูงจะไม่สามารถดำเนินไปได้ถ้าไม่ใช้วิธีการคัดเลือกที่มีประสิทธิภาพ และถูกต้องถึงระดับ พันธุกรรม


ที่มา:
https://web.ku.ac.th/schoolnet/snet4/genetics/pcr.htm

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *